16
1.2. Peptid bo'laklariga hazm qilish. Folding sekvensori.
Oqsillarni identifikatsiyalash - bu aminokislotalar ketma-ketligi asosida,
qiziqish bildiradigan oqsilga (POI) ism berish jarayoni. Odatda, oqsilni
genlarining DNK sekanslaridan chiqarilgan oqsillar sekanslari ma'lumotlar
bazalariga asoslanib aniqlash uchun oqsillar
ketma-ketligining faqat bir
qismini eksperimental tarzda aniqlash kerak. Keyinchalik oqsillarni tavsiflash
POI ning haqiqiy N- va C-terminalarini tasdiqlash, ketma-ketlik variantlarini
aniqlash va mavjud bo'lgan har qanday translyatsiyadan keyingi
modifikatsiyalarni o'z ichiga olishi mumkin.
Proteolitik hazm qilish
Proteinni identifikatsiyalashning umumiy sxemasi tavsiflangan.
[4][5]
1. POI izolyatsiya qilingan, odatda tomonidan SDS-PAGE yoki xromatografiya.
2. Sistein qoldiqlarini barqarorlashtirish uchun ajratilgan POI kimyoviy jihatdan
o'zgartirilishi
mumkin
(masalan,
S-amidometilatsiya
yoki
S-
karboksimetilatsiya).
3. POI peptidlarni hosil qilish uchun o'ziga
xos proteaz bilan hazm
qilinadi. Tripsin, lizin yoki arginin qoldiqlarining C-terminal tomonida tanlab
yorilib, eng ko'p ishlatiladigan proteaz hisoblanadi. Uning afzalliklariga i)
oqsillarda Lys va Arg qoldiqlarining chastotasi, ii) fermentning yuqori o'ziga
xosligi, iii) fermentning barqarorligi va iv) triptik peptidlarning mass -
spektrometriya uchun mosligi kiradi.
4. Peptidlar ionlashtiriladigan ifloslantiruvchi moddalarni yo'q qilish uchun
tuzsizlantirilishi va ta'sir qilishi mumkin MALDI-TOF mass-spektrometriya.
Peptidlarning massasini to'g'ridan-to'g'ri o'lchash oqsilni aniqlash uchun etarli
ma'lumotni berishi mumkin (qarang) Peptidning ommaviy barmoq izlari)
ammo peptidlarning ketma-ketligi haqida ma'lumot olish uchun ko'pincha mass
spektrometr ichidagi peptidlarning keyingi parchalanishidan foydalaniladi.
Shu
bilan bir qatorda, peptidlarni tuzsizlantirish va ajratish mumkin teskari
faza HPLC va an-orqali mass-spektrometrga kiritilgan ESI manba. LC-ESI-
17
MS oqsillarni identifikatsiyalash uchun MALDI-MS ga qaraganda ko'proq
ma'lumot berishi mumkin, ammo ko'proq vaqt sarflaydi.
5.
Mass spektrometr turiga qarab, peptid ionlarining parchalanishi turli xil
mexanizmlar orqali sodir bo'lishi mumkin. To'qnashuv natijasida kelib chiqqan
dissotsiatsiya (CID) yoki Manbadan keyingi parchalanish (PSD). Har ikkala
holatda ham peptidning bo'lak ionlari naqshlari uning ketma-ketligi to'g'risida
ma'lumot beradi.
6. Bashoratli peptid ionlarining va ularning
parchalanadigan ionlarining
o'lchangan massasini o'z ichiga olgan ma'lumotlar, keyinchalik kontseptual
(silikodagi) proteolizdan olingan oqsillar ketma-ketligi va ma'lumotlar
bazalarining parchalanishidan hisoblangan massa qiymatlariga mos keladi.
Muvaffaqiyatli o'yin, agar uning natijasi tahlil parametrlari asosida chegara
qiymatidan oshsa topiladi. Haqiqiy oqsil ma'lumotlar
bazasida namoyish
etilmagan bo'lsa ham, xatolarga chidamli moslik oqsilni o'xshashligi asosida
taxminiy identifikatsiyalashga imkon beradi. gomologik oqsillar. Ushbu
tahlilni amalga oshirish uchun turli xil dasturiy ta'minot to'plamlari mavjud.
7. Dasturiy ta'minot to'plamlari odatda har
bir aniqlangan oqsilning
identifikatsiyasini (qo'shilish kodini), uning mos kelishini ko'rsatadigan
hisobotni tuzadi va bir nechta oqsillar aniqlangan joyda mos keladigan
kuchning o'lchovini beradi.
8. Belgilangan oqsilning ketma-ketligi bo'yicha mos keladigan peptidlarning
diagrammasi ko'pincha ketma-ketlikni qoplashni ko'rsatish
uchun ishlatiladi
(peptid sifatida aniqlangan oqsilning%). POI mos keladigan oqsildan s ezilarli
darajada kichikroq deb hisoblangan joyda, POI aniqlangan oqsilning N - yoki
C-terminal bo'lagi ekanligini taklif qilishi mumkin.
