18
Yuqorida aytib o'tilganidek, oqsillarni aniqlash uchun qo'shimcha
dalillar
keltirishi mumkin.
N- va C-termini
Proteinni identifikatsiya qilish paytida mos keladigan peptidlar, mos keladigan
oqsil uchun bashorat qilingan N- yoki C-terminini o'z ichiga olmaydi. Buning
sababi, N- yoki C-terminal peptidlarni MS tomonidan aniqlash qiyin (masalan,
juda qisqa yoki juda uzun), translyatsiyadan so'ng o'zgartirilgan (masalan, N -
terminalli asetilatsiya) yoki bashoratdan chinakam farq qiladi. Translatsiyadan
keyingi modifikatsiyalar yoki qisqartirilgan terminlar ma'lumotlarni batafsil
o'rganish orqali aniqlanishi mumkin (ya'ni.)
de novo ketma-ketlik). Har xil
o'ziga xoslikdagi proteaza yordamida takroriy hazm qilish ham foydali bo'lishi
mumkin.
Tarjimadan keyingi modifikatsiyalar
Translatsiyadan keyingi modifikatsiyani aniqlash uchun MS ma'lum otlarini
ma'lum oqsillar ketma-ketligiga asoslangan
bashoratlar bilan batafsil
taqqoslashdan foydalanish mumkin, shuningdek ma'lumotlar yig'ish uchun
maqsadli yondashuvlardan foydalanish mumkin. Masalan, fosfopeptidlarning
o'ziga xos boyishi aniqlashda yordam berishi
mumkin fosforillanish oqsil
tarkibidagi joylar. Mass-spektrometrda peptid parchalanishining alternativ
usullari, masalan ETD yoki ECD, qo'shimcha ketma-ketlik ma'lumotlarini
berishi mumkin.
Butun massani aniqlash
Proteinning butun massasi uning aminokislota qoldiqlari massasi va suv
molekulasi massasining yig'indisidir va har qanday
translyatsiyadan keyingi
modifikatsiyalar uchun sozlangan. Garchi oqsillar ulardan olingan peptidlarga
qaraganda kamroq yaxshi ionlashtirsa-da, eritmadagi oqsil ESI-MS ta'siriga
tushishi va uning massasi 20000 dan 1 qismgacha aniqlikda o'lchanishi
mumkin. Bu ko'pincha terminini tasdiqlash uchun etarli bo'ladi (shuning uchun
oqsilning o'lchangan massasi uning ketma-ketligidan bashorat qilinganiga
19
to'g'ri keladi) va translyatsiyadan keyingi ko'plab modifikatsiyalar mavjudligi
yoki yo'qligi haqida xulosa chiqarish.
Cheklovlar
Proteoliz har doim ham POI ketma-ketligini qamrab oladigan, osonlikcha
tahlil qilinadigan peptidlar to'plamini beravermaydi.
Mass spektrometrdagi
peptidlarning parchalanishi ko'pincha har bir peptid bog'lanishida bo'linishga
mos keladigan ionlarni hosil qilmaydi. Shunday qilib, har bir peptid uchun
chiqarilgan ketma-ketlik to'liq bo'lishi shart emas.
Parchalanishning standart
usullari leytsin va izoleysin qoldiqlarini izomerik bo'lgani uchun ajratmaydi.
Edman degradatsiyasi oqsilning N-terminalidan kelib chiqqanligi sababli, agar
N-terminusi kimyoviy o'zgartirilgan bo'lsa (masalan, atsetilatsiya yoki
Piroglutamik kislota hosil bo'lishi bilan) ishlamaydi. Edman degradatsiyasi
odatda disulfid ko'priklarining holatini aniqlash uchun foydali emas.
Bundan
tashqari, sezgir natijalar uchun 1 pikomol yoki undan yuqori peptid miqdori
talab etiladi, bu esa undan kam sezgir bo'ladi mass-spektrometriya.
