Hajmni to‘ldirish.
Korxona usuliga ko‘ra tekshirilarni olib boriladi.
flakon tarkibini 10 ml graduirlangan o‘lchov silindr solib hajmni o‘lchashadi. 5 ta shunday flakonlarni xuddi shu usulda o‘tkaziladi.
Talab: 5,0 ml kam bo‘lmasin.
pH ga mos keluvchi tekshirishlar olib boriladi. Suyultirilmagan eritmani pH o‘lchamini o‘lchab pH metrga mos kelishini tekshiriladi. Talabi: 4,5 – 5,0.
Miqdoriy tahlil. Gramitsidin tarkibiningmiqdoriy tahlili.
Tekshirishlarni korxona usuli bo‘lgan turbidimetrik usulda olib boriladi.
Gramitsidin tarkibining tahlilini namunadagi dori vositasida olib boriladi:
1 ml namunani 54 ml etanolda gramitsidin eritmasini1 mg/ml hosil bo‘lguncha eritiladi.
Framitsitin sulfatning miqdoriy tahlili.
Tekshirishlarni korxona usuli bo‘yicha agardagi diffuziya usulida olib boriladi.
Framitsetin sulfat tarkibini namudagi jori vositasida aniqlanib, 5 ml namudani eritib olingan 100 mg/ml framitsetin eritmasi bilan mos kelishi kerak, takroran o‘tkaziladi.
Deksametazonva fenil etilli spirtni tarkibini miqdoriy tahlili .
Tekshirishlarni korxona usuliga mos bo‘lgan YUSSX usulida olib boriladi.
Reaktivlar:
0,04 M bufer: 13,6 g tetrabutilammoniya gidrogensulfat tortib 100 ml o‘lchov kolbasiga solinadi va 800 ml distillangan su bilan eritiladi. 34 ml 1N NaOH , 0,74 g limon kislota va 4,68 g quruq natriy fosfat ikki marta o‘rin almashuvchi qo‘shiladi. rN ko‘rsatkichlari 6,6 va 7,0 gacha o‘tkaziladi. Belgigacha bilan distillangan suv bilan etkaziladi.
Sitrat buferi, rN4,9 : 0,2 g limon kilota va 0,14 natriy sitratni 8000 ml distillangan suvda eritiladi. rN ko‘rsatkichlari 6,6 va 7,0 gacha o‘tkaziladi. Belgigacha bilan distillangan suv bilan etkaziladi.
Ichki standart eritma:
0,1% propilgidroksibenzoat ni metanoldagi eritmasi.
Standart eritma:
2,4 g (aniq tortma) fenil etil spirtdan 100 ml hajmli kolbaga solib, 10 ml etanol bilan eritiladi va sitrat buferi bilan hajmni belgigacha to‘ldiriladi, rN = 4,9.
0,080 g (aniq tortma) o‘lchanib natriy metasulbenzoat deksametozon ishchi standart ni 100 ml o‘lchov kolbasiga solinadi.
25,0 ml (aniq hajm) olib eritmaA o‘sha kolbaga solib, ultra to‘lqinda eriguncha ishlov beriladi. Sitrat buferi bilan hajmni belgigacha to‘ldiriladi, rN = 4,9. Eritma B.
10 ml (aniq hajm) olib eritma B 50 ml o‘lchov kolbasiga solib, 2 ml standart eritmasidan qo‘shib, sitrat buferi bilan hajmni belgigacha to‘ldiriladi, rN = 4,9. Ikkinchchi standart eritmani xuddi shu usulda tayyorlanadi.
Tekshirilayotgan eritma. ikkita har xil namunani har seriyadan tanlaniladi.
Usuli: 10 ml (aniq hajm) olib, 50 ml o‘lchov kolbasiga solib, 2,0 ml standart eritmasidan qo‘shib, sitrat buferi bilan hajmni belgigacha to‘ldiriladi, rN = 4,9. Aralshtiriladi va membranali filtr orqali filtrlanadi.
Xromatografik kolonkaga 20 mkl dan standart va tekshirilayotgan eritmalarni solinadi. Saqlash vaqti va dog‘ yuzasini nisbiy hisoblab topiladi.
Xromatografirlash muhiti:
Kolonka: 15×4,6 m zanglamaydigan po‘lat
Harakatlanuvchi faza: Metanol: 0,04 M bufer (60:40)
Harakatsiz faza : ODS – gipersil, zararcha o‘lchami - 5μ
Oqim tezligi : 1,2 ml/daq
Aniqlanish: UB, 254 nm to‘lqin uzunligi
Kiritish hajmi: 20 mkl
Mezgirligi: 256
Harorat : 30°S
Nisbiy saqlab turish vaqti:
Fenil etilli spirt: 0,6
Ichki standart: 1,0
Deksametazon: 1,9
YUSSX sharoiti absolyut hisoblanmaydi, shuning uchun bu paramtrlarni nisbatini harakatlanuvchifaza va oqim tezligi, kolonkaning ishlatilishni samaradorligiga mos kelishi kerak.
Standart va tekshirilayotgan eritmani dog‘ yuzasini ishlatib, konsentratsiya hisoblaniladi.
Hisoblash:
1. Fenil etilli spirt tarkibining tahlilni (X) % larda quyidagi formula orqali topiladi:
bu erda:
Aobr – tekshirilayotgan eritmaning xromatogrammasidagi deksametazon dog‘ining yuzasi
Ast- standart eritmaning xromatogrammasidagi deksametazon dog‘ining yuzasi
mct- fenil etilli spirtning standart namunasining tortmasi, g
R – quritilgan substansiyan i moddaning tarkibi, %
2. Deksametazon tarkibining tahlilni (Y)% larda quyidagi formula orqali topiladi:
bu erda:
Aobr – tekshirilayotgan eritmaning xromatogrammasidagi deksametazon dog‘ining yuzasi
Ast- standart eritmaning xromatogrammasidagi deksametazon dog‘ining yuzasi
mct- fenil etilli spirtning standart namunasining tortmasi, g
R – quritilgan substansiyan i moddaning tarkibi, %
Xromatografik tizimining yaroqliligini tekshirish:
Assimetriya koeffitsient dog‘ining 0,80 va 1,6 oralig‘ida bo‘lishi kerak.
Feniletil va ichki standart dog‘laring bo‘linish kriteriysi 5,0 dan kam bo‘lmasligi kerak.
Dog‘larning vaqti ±10 chetlanish ruxsat beriladi:
feniletilli spirt : 156 se
Ichki standart : 272 sek
Deksametazon : 517 sek
Sterilligi. Tekshirishlarning korxona talabi bo‘yicha membranali filtr usulida o‘tkaziladi.
Mexanik qo‘shimchalar. 10 ta flakon dan kam bo‘lmagani tanlab olib mexanik qo‘shimchalarni qora va oq fonga qarshi bo‘lishini aniqlashadi.
Talab: mexanik qo‘shimchalarni bo‘lmasligi vizual tekshirishda qora va oq fonda bo‘lmasligi.
Qotish nuqtasi. BF mos kelgan tekshirishlarda o‘tkaziladi.
Talab:0,5° S dan 0,6° S gacha
Gramitsidin tarkibini sifat tahlili.
Tekshirishlarni korxona usuli bo‘lgan turbidimetrik usulda olib boriladi.
Turbidimetrik usul.
Gramitsidin tarkibini tahlili namunadagi dori vositasida o‘tkaziladi:
1 ml namunani 54 ml etanolda gramitsidin eritmasini1 mg/ml hosil bo‘lguncha eritiladi.
Kultura muhiti
Oziqaviy sho‘rvasi.
Tarkibi:
Pepton 5,0 g
Achitqi ekstrakti 1,5 g
Go‘sht ekstrakti 1,5 g
Natriy xlorid 3,5 g
Dekstroza 1,0 g
Ikki marta o‘rinini bosuvchi kaliy fosfat 3,68 g
Bir marta o‘rinini bosuvchi kaliy fosfat 1,32 g
Distillangan suv 1000 ml
pH kattaligi: 7,0 ±0,05
Avtoklavda 20 daqiqada 121 °S haroratda sterilizatsiya qiliniladi.
Muhitni ushlab turish.Peptonli kazein agar.
Tarkibi:
Pepton 6,0 g
Pankreatik kazein sho‘rvasi 4.0 g
Achitqi ekstrakti 3.0 g
Go‘sht ekstrakti 1,5 g
Dekstroza 1,0 g
Agar 15.0g
Distillangan suv 1000 ml
pH kattaligi: 6.55 ±0,05
Avtoklavda 20 daqiqada 121 °S haroratda sterilizatsiya qiliniladi.
Reaktiv: Etanol.
Ingibitor eritmasi: 10% (mg/ml ) formaldegid ning tuzli eritmasi.
Tayyorlanishi:
0,85 g natriy xloridni erishigini ta’minlovchi suv hajmi bilan 90 ml hosil bo‘lguncha tayyorlaniladi. 10 ml 40% farmaldegid qo‘shiladi. 15°S kam bo‘lmagan haroratda saqlaniladi, yorqin yorug‘lik tushmasligi kerak.
Test mikrorganizm: Streptococcus Faecalis (ATCC 10541)
Test mikroorganizmini tayyorlash:
Streptococcus Faecalis (ATCC 10541) ni 100 ml ozuqaviy sho‘rvasida ushlab turiladi. Testni o‘tkazish uchun yangi tayyorlangan sub kultura tayyorlanadi, bu usulda ma’lum miqdordagi keltirilgan pepton kezein agarda tayyorlangan kulturani aralashtiriladi va 100 ml oziqaviy sho‘rvada 16-18 soat 37°S haroratda inkubatsiya qiliniladi. Miqdori tahlil har kungi inokulyatni 6 ml subkulturani har 1000 ml oziqaviy sho‘rvada ishlatilib o‘tkaziladi.
Ishchi standart eritmani tayyorlash:
50 mg standartni 3 soat davomida 60 °S harorat, 5 mm simob ustunida quritiladi. Aniq tortilgan moddani etanolda eritib, ishchi standart eritmani 100 mkg/ml konsentratsiyasini olinadi. Olingan eritmani muzlatgichda saqlab 30 kun mobaynida ishlatiladi.
To‘ldiriluvchi namunani tayyorlanishi:
50 mg to‘ldiruvchilarni 3 soat davomida 60 °S harorat, 5 mm simob ustunida quritiladi.
A) 25 mg → 25 ml
B)1 ml A → 100 ml
S)5 ml A → 50 ml
D) 4 ml S → 100 ml ( 0,04 mkg/ml)
(Hamma suyultirishlar etanolda olib boriladi)
Tekshirilayotgan eritmani tayyorlanishi
2 ml namunani etanol bilan eritib hajmni 100 ml etkaziladi, va so‘ng olingan etanolli grammitsidin 0,04 mkg/ml konsentratsiyasini olinadi (hisob kitob qilinib).
Tahlil:
har kungi ishlatiladigan standart eritmani ishchi standart eritmasidan alikvotni suyultirilib tayyorlanadi. 1 ml eritmani ishchi eritmasini standart etanoli bilan 100 gacha suyultirilib, 10 mkg/ml konsentratsiyali grammitsidin hosil bo‘lguncha olinadi. 2,8 ml, 3,4 ml, 4,0 ml, 4,8 ml va 5,8 ml olingan eritmadan tanlab olib 100 ml gacha etonol bilan suyultiriladi, 0.028, 0.034, 0.4, 0.048 va 0.058 mkg/ml konsentratsiyali grammitsidin hosil bo‘lguncha olinadi. 0,1 ml olingan konsentratsiyali har standart va tekshiriluvchi namunani 3 ta bir xil o‘lchami 18 mm × 150mm li bo‘lgan probirkalarga solinadi. Har bir probirkaga test o‘tkazish uchun 9 ml o‘stirilgan sho‘rvadan solinadi va suv hammomida 3-4 saot 37°S haroratda qizdiriladi. O‘sishni to‘xtatish uchun bitta seriyadagi probirkaga ekilgan sho‘rvani quyib, 0,2 ml 10% farmaldegid eritmasidan qo‘shiladi.
Probirkalar inkubatsion davrdan so‘ng suv hammomidan olinadi va har biriga 0,2 ml 10% farmaldegidning tuzli eritmasidan qo‘shiladi va yaxshilab eritiladi.
Gazlar erkin chiqib ketishi uchun probirkalarni 15 min ga qoldirib qo‘yiladi. Har bir probirkadagi xiralik kattaligini, to‘lqin uzunligi 580 nm bo‘lgan kalorimetr yordamida aniqlaniladi, solishtirish eritmasi sifatida farmolizlangan sho‘rva ishlatiladi.
Gramitsidan faolligini hisoblash:
o‘rtacha kattalik qiymatining absorbsiyasi har bir standart uchun ikki siklli yarim logarifmik grafikka chiqartiriladi. Unda absorbsiya - arifmktik shkala, konsentratsiya esa logarifmik shkala bilan belgilanadi. Namuna absorbsiyasining o‘rtacha kattaligi olinib, gramitsidin konsentratsiyasi esa standart egriligi balan hisoblanadi.
Namunadagi gramitsidin tarkibini olish uchun mos bo‘lgan suyultirish faktorini konsentratsiyaga ko‘paytirish orqali topiladi.
Ko‘rsatma:
Rossiya farmakopeyasiga binoan, agarga Bacillus cereus var mycoides 537 qo‘llab diffuziya qilish uculini gramitsidin faolligini aniqlash ham qo‘llanilishi mumkin.
Turbidimetrik va agarda diffuziya usullarida natijalarni farqlanishi kuzatilsa, turbidimetrik usuli tanlaniladi.
Framitsetin sulfat miqdoriy tarkibini aniqlash
Tekshirishlarni korxona usuliga mos keluvchi agarda diffuziya usulida aniqlaniladi.
Framatsidin sulfatni takribini namunadagi dori vositasida aniqlaniladi: 5 ml namunani mos keluvchi erituvchi bilaneritib 100 mg/ml framitsitin eritmasi olinadi, va qaytiiriladi.
Tahlil:
Agarda diffuziya usulida tekshiriliarni olib boriladi.
Kichik plastinalar usuli.
Dozalar nisbati 4:1.
Muhit:
1) Ushlab turuvchi muhit (Maintenance medium): A IP96 muhiti
2) Spora olish uchun muhit (Spore suspension medium): A IP96 muhiti
3) Faolligini aniqlash uchun muhit (Assay medium) :Oziqaviy agar ning rN kattaligi sterilizatsiyadan so‘ng 8,0±0,1.
Bufer eritmasi: 0,1 M fosfat buferi, rN 8,0.
Tayerlanishi:
16,73 g ikki o‘rinni bosuvchi kaliy fosfat
0,523 g bir o‘rinni bosuvchi kaliy fosfat
Yuqorida ko‘rsatilgan miqdordagilarni eritiladi va eritmaning hajmni 1000 ml gacha distillangan suv bilan etkaziladi. Eritmani rN kattaligini fosfor kislotasi yoki 10N kaliy gidroksid bilan aniqlashadi (rN kattaligi sterilizatsiyadan so‘ng 8,0±0,1).
Mikroorganizm – testini tayyorlash.
Sterilligini tekshirish uchun qattiq yopiilgan prbirkalarni inkubirlanadi, 24 soat davomida muhitni saqlanadi. Har bir probirkaga petli kosachasiga vegetativ organizmini engil sim orqali inokulyat ekiladi. Inkubatsiya jarayoni probirkalarda 16 soat mobaynida 37°S haroratda , so‘ng boshlang‘ich 4°S haroratda saqlanadi. Tarkibiy qatlamini Rouks bankasiga 250 ml muhit A ni 0,3 g/l magniy sulfat bilan inokulyasiya qilinadi.
Rouks bankasini inkubirlanishi 7 kun mobaynida 37°S haroratda olib boriladi. Agar sirtini 100 steril tozalangan suv bilan shishali dumaloqchalarni yordamchi suspenziya sifatida ishlatilib yuviladi. Buning natijasida suspenziyaga yig‘iladi.
Boshlang‘ich suspenziyani suv hammomida 30 daqiqa mobaynida 60°S haroratda qizdiriladi va 4°S haroratda saqlanadi. Bu jarayonni 3 kun mobaynida qaytiriladi. Bu suspenziya 3 oy davomida ishlatiladi. Ishlatishdan oldin boshlang‘ich suspenziyani 60% darajasida suvni o‘taqazishigcha suyultirilib 580 nm to‘lqin uzunligida mos bo‘gan kalorimetrda tekshiriladi.
Framitsitin sulfat standarti (har yildagi tayyorlanish:)
Framitsit sulfatga mos bo‘lgan miqdorda 10 g (10 g atrofida) Noecht Marin Roussel dan olib kelingan, partiyadan tanlab olinib, tashqi standart sifatida belgilanadi.
Tashqi standart standartlashda Noecht Marin RousselReference standartini ishlatib, tashqi standart sifatida belgilanadi.
Boshlang‘iya standart eritmasi:
aniq tortma olinadi va framitsit sulfatga mos bo‘lgan miqdorda (tashqi standart) steril tozalangan suvda shunday eritiladi 1000mg / ml boshlang‘ich eritmasi standart eritmasiga o‘xshab belgilanishi kerak bo‘ladi.
Framitsitin sulfat standartining ishchi eritmasi (har haftadagi tayyorlanish:)
10 ml standart eritmasni mos bo‘lgan bufer eritmasi bilan rN=8,0 bo‘lgan, 50 ml o‘lchov kolbasida (200 mg/ml) eritiladi.
Framitsitin sulfat standartieritmasini yuqori va past konsentratsiyasi (har kundagi tayyorlanish:)
2,5 ml (200 mg/ml) standart eritmasini fosfat buferi bilan rN=8,0 bo‘lgan, 25 ml o‘lchov kolbasida (20 mg/ml) eritiladi. (SN)
2,5 ml (200 mg/ml) standart eritmasini fosfat buferi bilan rN=8,0 bo‘lgan, 100 ml o‘lchov kolbasida (5 mg/ml) eritiladi. (SL)
Framitsitin sulfat ishchi standartining 20 mg/ml va 5 mg/ml konsentratsiyali eritmalarini ishchi doza uchun miqdoriy tahlilda ishlatiladi. Faollikni aniqlash uchun dozar nisbati 4:1.
Tekshirilayotgan eritmani tayyorlash.
Tekshirilayotgan eritma namunasining ekstraktini 0,1M fosfat buferida suyultirilib, rN=8,0 bo‘lgan 20 mg/ml konsentratsiyasi olinadi. Olingan eritmani yuqori konsentratsiyali ishchi eritma sifatida ishlatiladi. (TN) So‘ng yana tekshirilayotgan eritma namunasining ekstraktini 0,1M fosfat buferida suyultirilib, rN=8,0 bo‘lgan 5 mg/ml konsentratsiyasi olinadi.Olingan eritmani past konsentratsiyali ishchi eritma sifatida ishlatiladi. (TL)
Sterillangan Petli likopchasini (tashqi diametri 9 sm bo‘lgan) avtoklavda 20 daqiqa mobaynida 121°S haroratda ishlov beriladi.
Muhit eritiladi 60°S gacha sovutiladi va 13 ml muhitni har bir plastinkagalarga taqsimlanadi. Har bir namuna uchun minimal 4 ta plastina ishlatiladi. Qatlam asosni qotishini kutiladi. Qlogan muhitni 60 °S haroratda ushlab turilib 1% li B. Subtilis ATSS 6633 suspenziyaga ekiladi.
Aylanma holatda yaxshilab arlashtiriladi va 4 mldan ikkinchi qatlamga inokulyasiyalangan muhitni solinadi, asosiy qatlamni bir xil taqlash kerak bo‘ladi. Muhitni quyuqlashini kuzatiladi.
Plastinkada bir hil masofada taqsimlab o‘lchami 8 mm misli probkalar orqali 4 ta chuqurchalar hosil qilinadi va agar muhitidan kesib olingan bo‘laklar yo‘qotiladi.
50 mkl standart yuqori va past konsentratsiyali eritmadan bir biridan diagonal joylashgan chuqurchalarga solib qo‘yiladi.
50 mkl standart yuqori va past konsentratsiyali eritmadan qolgan ikki chuqurchalarga solib qo‘yiladi. Buning natijasida, standart va ishchi eritmalar turli xil chuqurchalarda bitta plastinkada joylashadi. Plastinkalarni xona haroratida 60 daqiqa qo‘yib qo‘yiladi, so‘ng 18 soat mobaynida 37°S haroratda inkubirlanadi va inkubatsiyalangan muhitni diametrini antibiotiklarni muhitini chegarasini o‘lchovchi asbob orqali hisoblab topiladi. Natijalarni kompyuter orqali to‘g‘rilanadi va tekshiriluvchi namunaning faolligini foizlarda hisoblab topiladi.
Hisoblash:
% Faolligi =Antilog 2 ± a log I
bu erda:
I = doza nisbati = SH:SL
 foiz tarkibini aniqlanishi
Saqlanish muhiti (A IP 96 muhiti:)
Pepton 6,0 g
Pankreatik kazein sho‘rvasi 4.0g
Achitqi ekstrakti 3.0 g
Go‘sht ekstrakti 1,5 g
Dekstroza 1,0 g
Agar 15.0g
Distillangan suv 1000 ml
Sterilizatsiya qilingandan
so‘ng pH kattaligi: 6.55 ±0,05
Spora olish uchun muhit (A IP 96 muhiti:)
Saqlanish muhiti (A IP 96 muhiti:)
Pepton 6,0 g
Pankreatik kazein sho‘rvasi 4.0g
Achitqi ekstrakti 3.0 g
Go‘sht ekstrakti 1,5 g
Dekstroza 1,0 g
Marganets sulfat 300 mg
Agar 15.0g
Tozalangan suv 1000 ml
Sterilizatsiya qilingandan
so‘ng pH kattaligi: 6.55 ±0,05
Anitibiotik foallini aniqlash uchun muhiti (A IP 96 muhiti:)
Pepton 6,0 g
Achitqi ekstrakti 3.0 g
Go‘sht ekstrakti 1,5 g
Natriy xlorid 5,0 g
Agar 15.0g
Distillangan suv 1000 ml
Sterilizatsiya qilingandan
so‘ng pH kattaligi: 8,0 ±0,1
Framitsitin sulfat faolligini agardagi diffuziya usuli orqali aniqlash
Framitsetin sulfatni standartini yozish:
100 mg
(670 TB/mg)
10 ml
2.5 ml
100ml
|
100 ml (Steril tozalangan suv)
50 ml
25 ml
100 ml
|
Bufer
rN=8,0
Bufer
rN=8,0
Bufer
rN=8,0
|
1000 mkg/ml
200 mkg/ml
20 mkg/ml
SH
5 mkg/ml
SL
|
Tekshirilayotgan namunani yozish (jadvalni davomi):
|
2 ml
2.5 ml
2.5 ml
|
50 ml
25 ml
100 ml
|
Bufer
rN=8,0
Bufer
rN=8,0
Bufer
rN=8,0
|
200 mkg/ml
20 mkg/ml
SH
5 mkg/ml
SL
|
| 