|
O’zbekiston respublikasi oliy ta’lim, fan va innovatsiyalar vazirligi farg’ona davlat universiteti qo‘lyozma shalkda
|
| bet | 12/23 | | Sana | 22.01.2024 | | Hajmi | 88,84 Mb. | | #142800 |
Bog'liq Magistrlik dissertatsiyasiII bob bo’yicha xulosa. Eng zamonaviy biotexnologik usullardan bo’lgan in vitro texnologiyasining tasnifi bobida in vitro texnologiyasining rivojlanish tarixi, qo’llash sohalari, o’simliklarni in vitro usulida vegetativ ko’paytirish, o’simliklarni mikroklonal ko’paytirish usullari, bosqichlari shu kabi ma’lumotlar berildi. Xulosa qilib aytganda in vitro usulining afzalliklari yuqori hisoblanadi. Juda ko’plab manzarali, noyob, qimmatbaxo, dorivor, oziq-ovqatbop, rizavor, yo’qolish arafasidagi turlar va shu kabi boshqa ko’plab turdagi o’simliklarni ko’paytirish mumkin.
BOB. AYRIM ISTIQBOLLI INTRODUTSENT MANZARALI O’SIMLIKLARNI BIOTEXNOLOGIK YO’L BILAN KO’PAYTIRIB ISTIQBOLLI O’SIMLIKLAR YETISHTIRISH.
3.1. O’simliklarni kulturalash, sterillash, oziqa muhitlar tasnifi.
Sterillash. O‘simlikdan ajratilgan to‘qimalar (eksplantlar) kulturalanadigan oziqa muhitining boy tarkibi mikroorganizmlar o‘sishi uchun ham yaxshi substrat hisoblanadi. Oziqa muhitda kulturalanayotgan o‘simlik eksplantlami mikroorganizmlar oson zararlaydi. Shuning uchun eksplant ham, oziqa muhiti ham sterillangan bo‘lishi shart. Ajratilgan to‘qimalar bilan olib boriladigan barcha ishlar (kulturaga o‘tkazish, yangi oziqa muhitiga ko‘chirish) steril xonalarda, (laminar bokslarda) steril asboblar yordamida amalga oshiriladi. Ajratilgan to‘qimalami
Laminar boksda sterillik unga o’rnatilgan bakterial filtrlar orqali
ta’minlanadi. Ish boshlashdan ikki soat oldin laminar boksda bakteriotsid ultrabinafsha lampalari yoqib qo‘yiladi. Idishlar quritish shkaflarida quruq issiq yoki avtoklavda nam bug’ yordamida sterillanadi. Sterillashdan oldin idishlami idish yuvish vositalari va kaliy bixromatning sulfat kislotasidagi eritmasi yordamida tozalab yuviladi, distillangan suvda chayiladi va zar qog'ozga yoki
oddiy qog‘ozga o‘rab, quritish shkaflarida 160°C haroratda 2 soat
davomida qizdirib yoki, 25-30 daqiqa 2 atmosfera bosim ostida
avtoklavlab sterillanadi. 0‘simlik materiallarini sterillash uchun quyidagi jadvalda berilgan eritmalardan foydalaniladi (3.1-jadval). O‘simlik materiallarini sterillash (R.G.Butenko 1999) 3.1-jadval
Obyekt
|
Sterillash vaqti
|
0,1%li Diatsid
(min)
|
0,1 % li sulema
|
10-12% li vodorod peroksid (min)
|
1
|
2
|
3
|
4
|
Quruq urug’lar
|
15-20
|
10-15
|
12-15
|
Ivitilgan urug’lar
|
6-10
|
6-8
|
6-8
|
Poya to’qimalar
|
20-40
|
20-25
|
-
|
Barglar
|
1-3
|
0,5-3
|
3-5
|
Apekslar
|
1-10
|
0,5-0,7
|
2-7
|
Sterillash vaqti. Kulturalash uchun olingan o‘simlik eksplantlari oldin sovunli suvda ishqalab yuviladi va distillangan suvda chayiladi, so‘ng bir necha
soniyada 70 % li etanolga solinadi, urug‘lar esa 1-2 min. ga spirtga solib
qo‘yiladi. Spirt to‘qimalami sterillash bilan birga asosiy sterillovchi
eritmaning sterillash samarasini ham oshiradi. Spirtdan so‘ng to'qimalar
steril suvda ham chayiladi. Tashqi sterillash faqat tashqaridagi infeksiyalardan holi qiladi. Agar eksplantda ichki infeksiya mavjud bo‘lsa, u holda antibiotiklar
bilan ishlov berish zarur. Asosan tropik va subtropik o‘simlik to‘qimalari
ichki infeksiyalarga boy boiadi. Zamburug’ yoki bakteriyalar bilan zararlangan kulturani ekilganidan 1-14 kundan so‘ng aniqlash mumkin. Mikroorganizmlar bilan zararlangan kulturalarni xonaga tarqalib havoni ifloslantirmasdan ularning oldini olish zarur. Oziqa muhitlari avtoklavda 120°C daqiqada 0,75-1 atm bosimda
20 daqiqa davomida sterillanadi. Agar oziqa muhit tarkibiga yuqori
haroratda parchalanib ketuvchi moddalar kiritilgan bo‘lsa, u holda bu
moddalar maxsus mayda teshikli (diametri 0,15-0,45 mkl teshikli)
bakterial filtrlardan o‘tkazib tozalanadi, so‘ng avtoklavga sterillanib va
40°C ga cha sovitilgan asosiy oziqa muhitga qo‘shiladi.(9)
Oziqa muhitlar. O‘simlikdan ajratilgan hujayra va to‘qimalar
ko‘p komponentli oziqa muhitlarda kulturalanadi. Ajratilgan hujayra va
to‘qimalami kulturalash uchun oziqa muhitlari tarkibida o‘simlik uchun
zarur bo‘lgan barcha makroelementlar (azot, fosfor, kaliy, kalsiy,
magniy, oltingugurt, temir) mikroelementlar (bor, marganes, rux, mis,
molibden va boshqalar), shuningdek, vitaminlar, uglevodlar,
fitogormonlar yoki ulaming analoglarini tutishi zarur. Ba’zi oziqa
muhitlarga kazein gidrolizati, aminokislotalar ham qo‘shiladi. Bundan
tashqari, hujayraning temirga bo‘lgan talabini qondirish uchun oziqa
muhitlar tarkibiga EDTA (etilendiamintetrasirka kislota) yoki uning
natriyli tuzi kiritiladi. Kallus to‘qimasi olish uchun ba’zi hollarda oziqa muhit tarkibiga kokos yong‘og‘ining suyuq endospermi (kokos suti), kashtan qo‘shiladi.
Uglevodlar ajratilgan hujayra va to‘qimalar kulturalanayotgan oziqa
muhitning zaruriy tarkibi hisoblanadi. Chunki ular avtotrof oziqlanish
xususiyatiga ega emas. Uglevod manbai sifatida 2-3% li konsentratsiyadagi saxaroza yoki glyukozadan foydalaniladi. Fitogormonlar hujayralarning dediffensiyalanishi va hujayralar bo‘linishini tezlashtirish uchun zarur. Shuning uchun kallus to‘qimalar olishda oziqa muhit tarkibida, albatta, auksinlar (hujayralar dedifferensiatsiyasini chaqiradi) va sitokininlar (hujayralar bo‘linishini
chaqiradi) bo‘lishi shart. Poya morfogenezini yuzaga keltirishda oziqa
muhitdagi auksinning miqdori kamaytiriladi yoki umuman qo‘shilmaydi.
Gormonsiz muhitda shish to‘qimalari yoki ko'nikkan to‘qimalar
o‘sadi. Ular o‘zlari gormon sintez qilish xususiyatiga ega bo‘ladi.
Oziqa muhitlarda auksin manbai sifatida 2,4—dixlorfenoksirka
kislota (2,4-D), indolil 3-sirka kislota (ISK), naftilsirka kislotasi (NKS)
dan foydalaniladi. G‘ovak, (po‘k) yaxshi o‘suvchi kallus to‘qimasi olish
uchun asosan 2,4-D dan foydalaniladi, chunki uning faolligi ISKga
nisbatan 30 marta yuqori. Sun’iy oziqa muhitlarda sitokinin manbai sifatida kinetin, 6-benzilaminopurin (BAP), zeatindan foydalaniladi. Ajratilgan to‘qima-
lami o‘stirishda, organlami hosil qilishda kinetinga nisbatan 6-BAP va
zeatindan foydalanish ko'proq samara beradi. Ba’zi oziqa muhitlar
tarkibiga adenin qo‘shiladi. Hozirgi vaqtda tarkibi jihatidan bir-biridan farq qiluvchi bir nechta oziqa muhitlari ma’lum. Lekin ajratilgan hujayra va to‘qimalami in vitro o‘stirish uchun, asosan, 1962-yilda T. Murasiga va F Skuga tomonidan yaratilgan tarkibdagi oziqa muhitlaridan foydalaniladi. Bu muhitda
oziqa moddalar tarkibi balanslangan bo‘lib, ammoniyli va nitratli
azotning nisbati bilan boshqalaridan farq qiladi. Qattiq oziqa muhiti
tayyorlash uchun dengiz suv o'tlaridan olinadigan polisaxarid agar-agar
moddasidan foydalaniladi. Makro-mikro elementlar tuzlari eritmalarini, shuningdek, vitaminlar va fitogormonlaming konsentrlangan (miqdori oshirilgan) eritmalarini tayyorlab, ulardan oz miqdorda olib, suyultirib ishlatish mumkin. Konsentrlangan boshlang‘ich eritmalar sovutgichda saqlanadi.
O‘simlikning ajratilgan hujayra va to‘qimalarini kulturalash uchun
oziqa muhitlar tarkibi (R.G.Butenko 1999) (3.2-jadval)
Ozuqa muhit komponentlari
|
Konsentrasiyasi mg/l
|
Murasiga-Skuga
|
Gamborga
|
Shenka-Xildebrandt
|
Gress-xoff-Dou
|
NHNO3
|
1650
|
2500
|
2500
|
-
|
NH4H2PO4
|
-
|
-
|
300
|
-
|
KNO3
|
1900
|
-
|
-
|
1000
|
CaCl+2H2O
|
440
|
150
|
200
|
150
|
MgSO4-7H2O
|
370
|
250
|
400
|
250
|
(NH4)2SO4
|
-
|
130
|
-
|
200
|
KH2PO4
|
170
|
-
|
-
|
-
|
Na2EDTA
|
37,3
|
37,3
|
20,0
|
37,3
|
FeSO4-7H2O
|
27,95
|
27,85
|
15,0
|
27,8
|
NaH2PO4-H2O
|
-
|
150
|
-
|
90
|
H3BO3
|
6,2
|
3,0
|
5,0
|
3,0
|
MnSO4-4H2O
|
22,3
|
10,0
|
10,0
|
10,0
|
ZnSO4-7H2O
|
8,6
|
2,0
|
1,0
|
3,0
|
KJ
|
0,83
|
0,75
|
1,0
|
0,75
|
Na2MoO4-2H2O
|
0,25
|
0,25
|
0,1
|
0,25
|
CuSO4-5H2O
|
0,025
|
0,025
|
0,2
|
0,25
|
CoU2-6H2O
|
0,025
|
0,025
|
0,1
|
0,25
|
Glitsin
|
2,0
|
-
|
-
|
2,0
|
Mezinozit
|
100
|
100
|
1000
|
10
|
Nikotin kislota
|
0,5
|
1,0
|
5,0
|
1,0
|
Piridoksin-HCl
|
0,5
|
1,0
|
0,5
|
0,1
|
Tiamin-HCl
|
1
|
10,0
|
5,0
|
0,1
|
2,4-D
|
-
|
0,1-1,0
|
-
|
-
|
Kinetin
|
-
|
0,1
|
0,1
|
-
|
Glutamin
|
-
|
-
|
-
|
-
|
Saxaroza
|
30 000
|
30 000
|
30 000
|
20 000
|
Klonli mikroko‘paytirishni muvaffaqiyatli amalga oshishida oziqa muhitining gormon muvozanati ham muhim omillardan biri hisoblanadi. Gormonlaming nisbati (sitokinin, auksin) yuqori bo‘lganda uchki meristemalar yoki adventiv kurtaklar rivojlanadi, past bo‘lganda ildiz hosil bo‘lishi indutsirlanadi, o‘rtacha bo’lganda esa kallus to'qimalari hosil bo‘lishi va proliferatsiyasi kuzatiladi.
Klonli mikroko'paytirishda auksin komponentlari sifatida ISK, ba’zi
hollarda NSK, sitokinin sifatida esa kinetin va BAP qo‘llaniladi.
O‘simliklarni mikroko‘paytirishda foydalaniladigan sitokininlami
uning faolligi bo‘yicha quyidagi tartibda joylashtirish mumkin: kinetin
< 6 benzil aminopurin (BAP) < 2-izopentiladenin (2 ip) < zeatin.
Sitokinin va auksinlardan tashqari oziqa muhitga ba’zida gibberal
kislotasi ham qo‘shiladi, u shakllangan kurtaklarni o‘sishini va
cho‘zilishi (elongatsiyasi) ni stimullaydi va yer ustki qismi yaxshi
rivojlangan o‘simlik olish imkonini beradi. Umuman olganda, to‘qimalar kulturasida turli morfogenetik ta’sirlanishining kam miqdordagi ekzogen fitogormonlari yordamida induksiyalash va stimullash mumkin va gormonlar bilan to‘yingan oziqa muhitlarda o‘simlik to'qimalarining umumiy faolligini batamom
yo‘qotishi yoki to‘qimalami nobud qilish mumkin. O‘simliklaming
kultralanayotgan organ va to‘qimalarini fitogormonlarga nisbatan
ta’sirlanish xususiyatini o‘simliklami o‘stirish maqsadida o‘sish
regulatorlaridan foydalanganda hisobga olish kerak. Klonli mikroko‘paytirishga gormonlar bilan bir qatorda mineral tuzlar, vitaminlar va uglevodlar ham ta’sir ko‘rsatadi. O'simliklami in vitro mikroko‘paytirish uchun Murasiga va Skuga, Linsmaer va Skuga, Gresxof va Dou, Nich, Xeller, Shenk va Xildebrandt va boshqa bir biridan ammoniyli va nitratli azot nisbati bilan farq qiluvchi oziqa
muhitlardan foydalaniladi. Ko‘pincha tadqiqotchilar yuqori tniqdorda
anorganik moddalar tutuvchi Murasiga va Skuga oziqa muhitlaridan
foydalanishni afzal biladidar. Azot bilan boyitilgan oziqa muhitlardan
foydalanilganda, nafaqat kallus to'qimasi hosil bo'lishiga, balki
organogenez va ayniqsa, somatik embriogenez jarayonlarini stimullanishiga ham erishish mumkin. Masalan, NH4NO3 Brassica ni har xil
turlari murtaklarini morfogenetik potensialiga ta’sir etadi. Murtaklami
yashovchanlik foizi va nihollar hosil bo'lish chastotasi NH4NO3 ning
muhitdagi miqdori kamaytirilganda oshadi, nihollaming va murtaklar
shakllanishining maksimal darajasiga NH4NO3 ishtirok etmaydigan
oziqa muhitida erishish mumkin. KN03 va NH4NO3 ning miqdori 6,7
ml gacha kamaytirilganda krijovnikning ba’zi navlarini morfogenezi
yaxshilanadi. Pomidor uchun mineral azotning miqdori oshirilgan oziqa
muhitda kallus hosil bo'lish jarayoni to'xtashi va eksplantlarning nobud
bo’lishi tajribalarda aniqlangan. Gloksiniya uchun vegetativ va
reproduktiv tuzilmalarning hosil bo'lishi oziqa muhit tarkibidagi komponentlarga bog'liq ekanligi aniqlangan, KN03 (20 ml) va saxarozaning
(100 ml) yuqori miqdorida ko'pincha vegetativ kurtaklaming
rivojlanishi, gul kurtaklarning rivojlanishi esa faqat 28% ni tashkil etishi
eksplantlarda kuzatilgan. Oziqa muhitda KNO3 (2 ml) va saxarozaning
(15 ml) kam miqdori barcha eksplantlarda faqat gul kurtaklar hosil
bo'lishiga sabab bo'ladi. Mikroko'paytirish jarayonlariga gormon tabiatiga ega bo'lmagan biologik faol moddalar, shuningdek, uglerodli oziqlantirish ham sezilarli
ta’sir ko'rsatadi. Ma’lumki, kallus to'qimalari hosil boiishi, undan
nihollarning regeneratsiyalanishi va embroidlarning paydo boiishi
uchun, oziqa muhiti tarkibida vitaminlar, aminokislotalar, o'simlik
ekstraktlari, kazein gidrolizati ishtirok etishi zarur. Agar nihollarning
rivojlanishi mavjud uchki meristemalar hisobiga yoki shakllangan
kurtak va embriodlar hisobiga boisa, u holda biologik faol moddalarning zaruriyati yo'q, chunki bunday nihollar o'zining hayot faoliyati
uchun zarur bo'lgan moddalami o'zi sintezlash qobiliyatiga ega.
Biologik faol moddalaming yuqori konsentratsiyasi gipervitaminozni
keltirib chiqaradi, natijada o‘sish cheklanadi, barglarining qorayishi va
qurishi, o‘simlik morfologiyasining o‘zgarishiga olib keladi.
Klonli mikroko’paytirishning barcha bosqichlarida uglevod manbai
sifatida 3%li saxarozadan foydalaniladi. Lekin, bu miqdomi barcha
o'simliklami in vitro o‘stirish uchun optimal, deb bo‘lmaydi. Qora
qarag‘ayning ajratilgan murtaklarini o‘sishida saxarozaning yuqori
miqdori (23 %) adventiv kurtaklarning paydo bo’lishiga salbiy ta’sir
ko‘rsatishi aniqlangan. Ikkinchi passajda bu jarayon amalga
oshmaganligi va to‘rtinchi passajda barcha eksplantlar nobud bo‘lganligi
kuzatilgan. Oziqa muhitdagi saxaroza konsentratsiyasining kamligi
nafaqat adventiv kurtaklarning paydo bo'lishini, balki uning rivojlanib
nihol hosil qilishini ham stimullaydi. Nihollar saxarozaning 0,5-1 % li
miqdorida 2-3 oy kulturalanganida 1-1,5 sm uzunlikka ega bo‘ladi,
ulardan ko‘paytirish yoki ildiz ottirish uchun foydalanilgan.
Uglerod manbai sifatida saxaroza bilan bir qatorda glyukoza,
fruktoza, galaktoza va boshqalardan ham foydalanish mumkin.
Ma’lumki, in vitro o‘simliklar to‘qimasini kulturalashda uglevodli oziqa
sifatida foydalaniladigan manbalardan glyukoza saxarozadan keyingi
o‘rinni egallaydi. o‘rganilgan 38 ta o'simlik kulturalaridan (o‘tchil va
yog'och poyali o’simliklar) 85 %li glyukozali muhitda ham juda yaxshi
o‘sgan. Glyukozadan keyingi o‘rinni fruktoza egallaydi. Minoxning
fikricha, kulturalanayotgan o‘simliklarning 2/3 qismi o‘sishida fruktozadan muvaffaqiyatli foydalanilgan. Ajratilgan o‘simlik to‘qimalariga
ta’siri bo‘yicha, galaktoza glyukoza va fruktozaga nisbatan farq qiladi.
O‘rganilgan o‘simlik kulturalardan deyarli yarmi galaktozali muhitda
yomon o'sgan yoki umuman o'smagan. Lekin o‘simliklar organ va
to'qimalarining o'sishida galaktozaning ijobiy roli haqida ham
ma’lumotlar bor. Shunday qilib, gormonlar, biologik faol moddalar va
mineral tuzlardan foydalanish muammosini tayyor reseptlar asosida,
oziqa muhit tarkibiga bu birikmalarni kiritish orqali emas, balki
mikroko‘paytirishda foydalanilayotgan u yoki bu o‘simlik turlarining
aniq morfogenetik reaksiyasini hisobga olgan holda hal etilishi lozim.
Fizik omillar. Oziqa muhitning qattiq, suyuq holatda bo‘lishi ham
eksplantlaming o‘sishi va adventiv kurtaklarning paydo qilish
jarayonlariga ta’sir etuvchi muhim omillardan biri hisoblanadi.
Ma’lumki, nihollarning uchki qismidan olingan eksplantlar suyuq oziqa
muhitlarda roller tipidagi apparatiarda kultralanganda ulaming o‘sishi
sezilarli darajada stimullanadi, nihollaming apikal dominantligi aniq
namoyon bo‘lmaydi, o'sish davri va qayta ekishlar soni qisqaradi, bu
o'simliklarga oziqa moddalar bilan yaxshi ta’minlanish imkonini beradi.
Boshqa tomondan qaraganda, bu sharoitda anomal, egri-bugri
nihollaming paydo bo'lish ehtimoli ortadi. Agarli oziqa muhitlardan
foydalanish orqali bu muammolarni yo'qotish mumkin, lekin shu bilan
birga bu usul eksplantlami oziqlanish sharoitini yomonlashtiradi va
metabolizm mahsulotlari chiqib ketishiga to'sqinlik qiladi.
Shuningdek, o'simliklaming klonli mikroko'payishi va o'sishida
oziqa muhitining pHi ham ta’sir etadi. Ma’lumki, kuchli kislotali yoki
ishqoriy muhitda ba’zi elementlar masalan, fosfor, temir erimaydi,
bundan o'simliklaming o'sishi cheklanadi. Lekin yuqori kislotali
muhitda bu elementlaming eruvchanligi oshishi, ko'p miqdorining
eritma holatiga o'tishi eksplant uchun zaharli ta’sir ko'rsatadi.
O'simliklami organ va to'qimalari pH 5,6-5,8 bo'lgan oziqa
muhitlarda kulturalanadi. Ammo bu sharoit har doim ham optimal
bo'lavermaydi. Masalan, oddiy qarag'ay murtaklari uchun oziqa
muhitining kislotalik darajasi 4,7 dan 5,2 gacha o'zgartirilganda
murtaklaming 2,3-3 marotaba ko'p adventiv kurtaklar hosil qilishi
aniqlangan, oddiy qoraqarag'ay uchun esa muhitning eng optimal pH
ko'rsatkichi 5,2-5,6 oralig'ida deb topilgan. Bu natijalar yuqorida
nomlari keltirilgan o'simlik turlari o'sadigan tuproqning kislotalik
darajasi bilan deyarli mos keladi. Shuning uchun to'qimalar kulturasi
bo'yicha tajribalar o'tkazishda, o'rganilayotgan o'simlik o'sadigan
tabiiy sharoitdagi tuproqning kislotalik darajasini ham hisobga olish
zarur. Odatda ajratilgan o'simlik to'qimalari boshlang'ich o'simlikning
intensivlik va fotojarayonga bo'lgan talablarini hisobga olgan holda,
lyuminessentli lampalar yorug'ligi ostida o'stiriladi. Murasiga
o'simliklami klonli mikroko'paytirishning birinchi va ikkinchi bosqichlarida to'qimalami 1-5 ming Ikda 14-16 soatli fotojarayonda o'stirishni
tavsiya qiladi, yoritishning bu sharoiti ko'pchilik o'simliklaming nihol
va ildizlarining paydo bo'lishiga yordam beradi. 0‘simliklarning o‘sishi va rivojlanishini boshqaruvchi sun’iy regulatorlar fitogormonlami boshqarish mexanizmlari haqidagi bilimlarga ega bo’lishi, o‘simliklaming hosildorligini, chidamliligini oshirishga erishishda, ulaming o‘sishi va rivojlanishini boshqarishda katta imkoniyatlar yaratadi. O‘simliklaming fitogormon tizimiga yo‘naltirilgan ta’sirlar o‘simliklaming o‘sishi va rivojlanishini boshqaruvchi regulatorlari
(fitoregulator) yordamida amalga oshiriladi.(10)
|
| |
