Biokimyodan laboratoriya mashg’ulotlari 1-mashg’ulot laboratoriya mashg’ulot darsiga kirish va laboratoriya texnikasi bilan tanishtirish

Download 397,5 Kb.
bet	14/32
Sana	13.12.2023
Hajmi	397,5 Kb.
	#117673

1 ... 10 11 12 13 14 15 16 17 ... 32

Bog'liq
Biokimyodan laboratoriya mashg printga (2)

g) MILLON REAKSIYASI
Kerakli reaktiv va asboblar: 1.Oqsil eritmasi; 2. 0,1% li fenol eritmasi; 3. 1% li jelatina; 4. Millon reaktivi; 5. Probirkalar; 6. Pipetkalar; 7. Shtativ; 8. Elektr plitka yoki gaz gorelka.
Fenol va uning hosilalarini, Millon reaktivi bilan qo'shib qizdirilganda, to'q qizil rangli simob birikmalari hosil bo'ladi. Bu reaksiya, o'z molekulasida fenol turkumi bo'lgan tirozinning Millon reaktivi bilan hosil qilgan nitrohosilaning simobli tuziga xosdir.
Shuning uchun ham tarkibida tirozin tutgan ko'pgina oqsillarni Millon reaktivi bilan qo'shib qizdirilganda to'q qizil rangli cho'kma hosil bo'ladi. Agar oqsil tarkibida tirozin bo'lmasa, Millon reaksiyasi kuzatilmaydi.

Tirozin
Ishning bajarilishi. Uchta probirka olib, ularning biriga 1 ml fenol eritmasidan, ikkinchisiga 1 ml oqsil eritmasidan va uchinchisiga asa 1 ml jelatina eritmasidan olib, ularning ustiga 4 - 5 tomchi Millon reaktividan qo'shiladi. Reaktivni solish bilan ikkinchi probirkada oqsil cho'kmaga tushadi. Probirkalar asta-sekin olovda qizdirilada. Natijada birinchi-ikkinchi probirkalarda qizil rang hosil bo'ladi. Uchinchi probirkada rang hosil bo'lmaydi.
Uchinchi probirkada rangning hosil bo'lmasligi, jelatana tarkibida aminokislotaning yo'qligidan dalolat beradi. Olingan natijalar daftarga yozib olinadi va ulardan tegishli xulosalar chiqariladi.

8-МАШҒУЛОТ
Гель-фильтрация, электрофорез ва ион-алмашинув хроматографиялари усулларини ўрганиш
Хроматография усули икки ва ундан ортиқ аралашмаларни (харакатчан) харакатсиз қават орқали фазаларга ажралган ҳолда фильтрланиб ўтишига асосланган. Хроматографияларни қуйидаги турлари мавжуд: адцорбцион, тақсимловчи, ион алмашинув, молекуляр элак, аффин, биоспецификлик хроматографияларидир.Харакатсиз фаза турига кўра улар қоғоз, юпқа қаватли, колонкали хроматография ва газ хроматографияларига бўлинади.
Гельфильтрация (гель хроматография) – мазкур усул моддаларни ажратиш катта молекулалар гелни яъни харакатсиз фазани ичига кира олмасдан ташқарида қолишлари ва харакатчан фаза билан колонка бўйлаб пастки томонга хараатланишига асосланган. Кичик хажмга эга бўлган молекулалар эса доналар ичига эркин равишда шимилади. Кейинчалик гель ичига кириб олган моддалар эюирловчи суюқлик тезлигини ошириш орали ювиб чиқарилади. Гель хроматографияда ажратиб олиниши керак бўлган модда хусусиятидан келиб чиққан ҳолда, сефадексни турли кўринишларидан фойдаланилади (Масалан: G100, G200 ва х.к.). Қуйида ачитқиларда кенг тарқалган инвертаза ферменти гель-фильтрацияси билан танишамиз.
Маълум даражада тозаланган инвертаза таркибли супернатантни гель-фильтрацияси учун 2.5х60 см хажмли G-100 сефадекси билан тўлдирилган колонка танлаб олинади. Сефадекс олдиндан рН и 7,5 бўлган 0,01 М трис-НCL буфери билан ишлов берилиши лозим. Колонка сефадекс билан тўлғизилгандан кейин оқсил фракцияси колонкага қуйилиб, буфер эритмаси билан элюирланади. Элюрланиш тезлигини 20 мл/соат қилиб белгилаш мумкин. Колонкадан элюирланган оқсил фракцияси (ҳар бир фракция 4 мл дан иборат) таркибида фермент миқдорини аниқлаш учун уни Лоури усулида миқдоий анализ қилинади. Шунингдек, фракциялар таркибида энг юқори фермент фаоллигига эга фракция танлаб олинади ва келгусида ишлатилиши ёки ион-алмашинув хроматографияси ёрдамида тозалаш мумкин.
Ион алмашинув хроматографияси ион алмашинув смолари ҳамда тозаланиши лозим бўлган модда ўртасида манфий ва мусбат зарядларни бир-бирига тортишиши орқали боғланишига асосланган. Бу усулда оқсил эритмаси фаол ион алмаштирувчи қаттиқ полимер масса – смола билан тўлдирилган колонка орқали ўтказилади. Смолалар харакатчан алмашинадиган катион ва анион тутади. Маълум шароитда ионитларнинг эркин ионлари оқсилни қарама-қарши ўқланган ионлари билан таъсирлашади. Лабораторияда мусбат ўқланган ионитлардан полистерол ва целлюлозани органик асослари ва аминли хосилалари, манфий ўқланган ионитлардан сульфо ва карбоксил тутган полистероллар ва карбоксиметилцеллюлоза кўпроқ қўлланилади.
Ферментни ион алмашинув хроматографияси усулида тозалаш учун 0,01 М трис-НCl буфери билан (рН 7,5) ишлов берилган диэтиламиноэтилцеллюлоза (мусбат ўқланган) смоласи билан тўлдирилган 110 см ли колонка танлаб олинади. Буфер эритмасида эритилган оқсил фракцияси колонкага жуда секин тезликда (20 мл/соат) юборилади. Смолага бириккан оқсил юқори тезликда (40-60 мл/соат) 1.0 М натрий хлорид эритмаси билан ювиб ажратиб олинади.
Электорофорез усуллари оқсил зарраларини электр майдонидаги харакатчанлигини белгилашга асосланган. Электр майдонида силжиш тезлиги молекуланинг зарядига, шакли ва массасига боғлиқ. Кейинги йиллларда электрофорез учун қаттиқ мухит сифатида крахмал гели, агар гели, полиакриламид гели ва бошқалар қўлланилиб келинмоқда. Оқсиллар электрофорези оқсилларни натив (Дэвис усули) ва денатурацияга учраган (Лэмли усули) ҳолларда олиб борилиши мумкин. Қуйида оқсилларни полиакриамид гели ёрдамида додецилсульфат натрий тузи иштирокидаги электрофорез билан танишиб чиқамиз.
Денатурланган шароитдаги электрофорез қалинлиги 1 мм эга вертикал пластинкада олиб борилади. Бунда қўлланилаётган гелнинг концентрацияси 5-12% ни ташкил қилади. Полиакриламид гелида шунингдек 1,5 М Трис-HCl (рН 8,8) ва 0,1% додецилсульфат натрий тузи бўлади. Акриламидни полимеризацияси учун аммоний персульфат ва N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин тузлари қўлланилади. Электрод буферлари 0,02 М Трис-HCl, 0,19 М глицин ва 0,1% ДСН дан ташкил топган. Гельни сорбентга бириктиришдан олдин 4 % ДСН, 10 % меркаптоэтанол ва 0,004 % бромфенол кўки билан қайнатилади. Фиксация бўлган оқсилларни метанол, сирка кислота ва сув (50:10:40) эритмасидаги кумасси G-250 эритмаси билан бўялади. Бунда намунага нисбатан конрол сифатида маркер оқсиллар ажратиб олинади.

Download 397,5 Kb.

1 ... 10 11 12 13 14 15 16 17 ... 32

Download 397,5 Kb.